食品中志賀氏菌要檢測(cè)哪些東西？志賀氏菌的檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)解析

志賀氏菌病常為食物暴發(fā)型或經(jīng)水傳播。和志賀氏菌病相關(guān)的食品包括色拉，生的蔬菜、奶和奶制品、禽肉、水果、面包、漢堡包及有鰭魚(yú)類(lèi)。志賀氏菌在擁擠和不衛(wèi)生條件下能迅速傳播，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于人員大量集中的地方，如餐廳、食堂。因此食品檢測(cè)中志賀氏菌病檢測(cè)項(xiàng)目必不可少，那食品中志賀氏菌檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)有哪些？

5 檢測(cè)方法

5.1 分離培養(yǎng)

增菌：稱(chēng)取待檢樣品25g，加入裝有225mL志賀氏菌增菌肉湯的500mL廣口瓶?jī)?nèi)，固體食品應(yīng)用均質(zhì)器以8000～10000r/min打碎1min，或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品應(yīng)用滅菌金屬匙或玻璃棒研磨使其乳化，于（36±1）℃培養(yǎng)6～8h。

分離培養(yǎng)：取增菌液1環(huán)，劃線(xiàn)接種于志賀氏菌選擇性瓊脂平板或志賀氏菌顯色培養(yǎng)基上，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24h。觀察平板或培養(yǎng)基上菌落形態(tài)，根據(jù)志賀氏菌在不同培養(yǎng)基上的菌落特征進(jìn)行可疑菌落的判定。

5.2 生化鑒定

挑取平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和半固體各一管。志賀氏菌屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果為底層變黃、不產(chǎn)氣（福氏志賀氏菌6型可微產(chǎn)氣），斜面不變色，不產(chǎn)生硫化氫，無(wú)動(dòng)力；在半固體管內(nèi)沿穿刺線(xiàn)生長(zhǎng)。應(yīng)進(jìn)一步做苯丙氨酸脫氨酶、賴(lài)氨酸脫羧酶，西蒙氏檸檬酸鹽和葡萄糖銨尿素、KCN、水楊苷、七葉苷試驗(yàn)，志賀氏菌屬均為陰性反應(yīng)。必要時(shí)應(yīng)做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗(yàn)，應(yīng)為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌，并以生化試驗(yàn)方法做4個(gè)生化群的鑒定。具有以上特性的菌株，疑為志賀氏菌，可做血清凝集試驗(yàn)。

5.3 血清學(xué)分型

挑取三糖鐵瓊脂上的培養(yǎng)物，做玻片凝集試驗(yàn)。先用4種志賀氏菌多價(jià)血清檢查，如果由于K抗原的存在而不出現(xiàn)凝集，應(yīng)將菌液煮沸后再檢查，再用A1、A2、B群、多價(jià)D群血清分別試驗(yàn)，如系B群福氏志賀氏菌，則用群和型因子血清分別檢查，確定菌型。福氏志賀氏菌型鑒定的方法：可先用群因子血清檢驗(yàn)，再根據(jù)群因子血清出現(xiàn)凝集的結(jié)果，依次選用型因子血清檢查。4種志賀氏菌多價(jià)血清不凝集的菌株，可用鮑氏志賀氏菌多價(jià)血清1、2、3分別檢查，并進(jìn)一步用1～15各型因子血清確定菌型，如果不是鮑氏志賀氏菌，可用痢疾志賀氏菌3～12型多價(jià)血清及各型因子血清檢查。

5.4 分子生物學(xué)鑒定

5.4.1 DNA模板的制備

取增菌液1mL于小離心管中，4000～5000r/min離心5min，棄上清液，向菌沉淀中加入50μL滅菌純水制成菌懸液，混勻后100℃煮沸10min，12000r/min離心5min，取上清液作為PCR模板。

5.4.2 引物設(shè)計(jì)

上游引物為5′-GTTCCTTGACCGTTCCGATACCGTC-3′；下游引物為5′-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3′。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為629bp。

5.4.3 PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)體積25μL：10×buffer2.5μL，TaqDNA聚合酶（2U/μL）0.5μL，MgCl2溶液（25mmol/L）3μL，dNTP（25mmol/L）1μL，ddH2O14μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10mol/L）1μL，模板2μL。

5.4.4 PCR反應(yīng)參數(shù)

95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5min。4℃保存。

注：PCR反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因擴(kuò)增儀型號(hào)的不同進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

5.4.5 電泳

用核酸電泳緩沖液（TAE）制備1.8%～2.0%的瓊脂糖凝膠，取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別和2μL上樣緩沖液混合進(jìn)行點(diǎn)樣，用DNA分子量標(biāo)記物做參照，3～5V/cm恒壓電泳，電泳20～40min，電泳檢測(cè)結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并保存。

5.4.6 結(jié)果判定

在陰性對(duì)照未出現(xiàn)條帶、陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶條件下，如待測(cè)樣品未出現(xiàn)629bp大小的擴(kuò)增帶，則判為陰性；如待測(cè)樣品出現(xiàn)629bp大小的擴(kuò)增帶，則判為陽(yáng)性。

如果陰性對(duì)照和（或）陽(yáng)性對(duì)照未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，則本次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重新試驗(yàn)。

目前，針對(duì)志賀氏菌的特點(diǎn)和危害，國(guó)家衛(wèi)生部已將志賀氏菌列入了肉、蛋、水產(chǎn)、飲料、調(diào)味品、糖果及酒類(lèi)等食品的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中。

并制定了與之相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

食品中志賀氏菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)志賀氏菌檢驗(yàn)》(GB4789.5-2012)。